Bilaga 3. PCR-diagnostik av diarréframkallande E coli och EHEC

Från Referensmetodik för laboratoriediagnostik

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik: Tarminfektioner, 2:a upplagan 2002

---

EJ REDIGERAD

Innehåll 1 PCR-diagnostik av EHEC, EIEC, EPEC och ETEC (SMI) 1.1 Analysprincip/teststrategi 1.2 Reagens 1.2.1 Analysprocedur 1.3 PCR 1.4 Post-PCR 2 REFERENSER

PCR-diagnostik av EHEC, EIEC, EPEC och ETEC (SMI)

Analysprincip/teststrategi

Prov utodlas på medium som selekterar för gramnegativa aeroba bakterier. De utväxta bakterierna i primärstryk eller enskilda kolonier slammas, kokas, och analyseras med PCR.

Tabell 31.

• Målgen Bakterietyp Amplimer

• stx1 EHEC/Shiga-/verotoxigena 130 (bp)
• stx2 EHEC/Shiga-/verotoxigena 298 (bp)
• eae EHEC/EPEC 376 (bp)
• ial EIEC/Shigella 320 (bp)
• bfpA EPEC 367 (bp)
• eltB ETEC 322 (bp)
• estA ETEC 147 (bp)

Reagens

Kontroller (tabell 17) slammas i PBS till en täthet motsvarande MacFarland 4 (undantag ATCC 43890 som slammas till 8). Templat-DNA från de två EHEC stammarna blandas i förhållandet 1+1.

Negativ kontroll E.coli ATCC 11775.

AmpliTaq, Taq polymeras 5 U/µL, GeneAmp 10xPCR-buffert II & 25 mmol/L MgCl2, Perkin Elmer.

dNTP; dATP, dCTP, dGTP och dTTP, ultrapure.

Analysprocedur

• Slamma bakterieväxten från primärstryket på en sorbitol-MacConkey-agarplatta i rör med PBS till en täthet motsvarande MacFarland 4 (cirka 10⁹-5x10⁹ bakterier/mL).
• Om bara ett fåtal kolonier vuxit ut eller isolat analyseras, slamma en koloni per 40µL PBS.
• Koka röret i 20 minuter.
• Reaktionsrör med 40µL bakterieslammning behandlas i 10 minuter vid 98-100 °C.
• Pelletera cellresterna.

PCR

• Mix / PCR-rör antal µL
  • GeneAmp 10x PCR buffert II 2,0
  • dNTP 1,25mmol/L 1,6
  • MgCl₂ 25mmol/L 1,2
  • Primer av varje 2,5µmol/L 0,4
  • Taq 5U/µL 0,1
  • sterilt H₂O upp till 18,0 µL

Tillsätt 2µL templat-DNA (prover resp. kontroller) till resp.PCR-rör.

• PCR-program

• • 4 min 96°C
  • 20 sek 94°C
  • 20 sek 55°C 30 cykler
  • 10 sek 72°C

7 min 72°C

Post-PCR

10 µL av reaktionsvolymen från varje rör analyseras med agarosgelelektrofores, motsvarande 2 % agaros (Seakem GTG) 120V, 30 minuter. Om stx1 eller estA (130bp resp.147bp) är svaga kan agaroshalten ökas för att ge skarpare band. Analysen påvisar närvaro eller frånvaro av de amplimerer som anges i tabell 31.

REFERENSER

• Målgen Åtkomstnummer EMBL DNA-databas
• stx1 X07865
• stx2 X07865
• eae X60439
• bfpA Z12295
• eltB Ref: Yamamote, T. And Yokota. 1983. Sequence of heatlabile enterotoxin of E.coli pathogenic to humans. J. Biol. Chem. 259, 5037-5044.
• estA Ref: Stieglitz H, Cervantes L, Robledo R, Covarrubias L, Bolivar F and Kupersztoch YM 1988. Cloning, sequencing and expression in Ficoll-generated minicells of an E.coli heat-stable enterotoxin gene. Plasmid 20, 42-53.
• ial Ref: Frankel G, Riley L, Giron J et al. 1990. Detection of Shigella in faeces using DNA amplification. J. Inf. Dis. 161, 1252-1256